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黃芩苷與其苷元黃芩素是黃芩的主要有效成分，具有抗菌、抗炎、抗HIV病毒、擴(kuò)張血管、清除自由基、抗氧化、抗腫瘤、降壓和利尿等多種藥理作用[-6，是含黃芩制劑的主要質(zhì)量控制指標(biāo)。有文獻(xiàn)報(bào)道，黃芩苷是復(fù)原型前體藥物，口服后并不完全直接被吸收，大部分在腸內(nèi)經(jīng)腸道菌群作用轉(zhuǎn)化為苷元黃芩素而被吸收入血，再在體內(nèi)迅速地轉(zhuǎn)化為黃芩苷。因此，在黃芩苷及其苷元黃芩素的體內(nèi)吸收、代謝過程中，腸道菌群有著重要的作用，甚至影響藥效的發(fā)揮[7-13]。抗生素類藥物能影響細(xì)菌的增殖，引起腸道菌群的改變，可能會影響黃芩苷及其苷元黃芩素在腸道中的吸收代謝乃至藥效2。然而，與此有關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道很少，因此，本實(shí)驗(yàn)采用抗生素誘導(dǎo)大鼠腸道菌群失調(diào)，研究在腸道菌群失調(diào)條件下黃芩苷和黃芩素在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)特征。長期使用抗生素后，對抗生素敏感的正常腸道菌群是否失調(diào)可以通過平板活菌計(jì)數(shù)法判定。該方法計(jì)數(shù)的線性范圍大，能較好地反映菌落的疏密程度，重復(fù)性、平行性亦好4。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇用抗生素鹽酸林可霉素制備腸道菌群失調(diào)模型(平板活菌計(jì)數(shù)法判定)，研究等摩爾劑量(370 umol/kg) 的黃芩苷和黃芩素在模型大鼠與正常大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)行為差115-161。
材料1.1 儀器 TSQ QUANTUM型三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀;Thermo MLtiMate 3000型超高效液相色譜儀;LDQUAN數(shù)據(jù)處理系統(tǒng); Allegra 型Beckman超速冷凍離心機(jī); VXRB S25型IKA VIBRAX basic自動渦旋振蕩儀; SG8200H 型超聲波清洗器; 2XZ-1型旋片式真空泵;AB104-N Mettler 型電子天平;立式壓力蒸汽滅菌器; BBS-V800超凈工作臺; DNP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱。
1.2 藥品與試劑 鹽酸林可霉素注射液(規(guī)格2mL，0.6g)，批號1503252;對照品黃芩苷(HPLC測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%，批號110715-201312)、 黃芩素(HPLC 測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%，批號110715-201214)、 染料木素(HPLC測定質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%，批號110714-201216)均購于中國食品藥品檢定研究院;麥康凱培養(yǎng)基、腸球菌瓊脂培養(yǎng)基、雙歧桿菌培養(yǎng)基、乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基、平板計(jì)數(shù)瓊脂，均購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;娃哈哈純凈水。
1.3 動物 健康雄性SD大鼠， 體質(zhì)量(220士20) g,重慶騰鑫比爾實(shí)驗(yàn)動物銷售有限公司提供，許可證號SCXK渝2007-0005。
2 方法與結(jié)果
2.1 腸道菌群失調(diào)模型的制備及評價(jià)
2.1.1 腸道菌群失調(diào)模型的制備 SD大鼠隨機(jī)分為抗生素組和對照組，每組6只?？股亟M大鼠ig鹽酸林可霉素4mL,每天1次;對照組大鼠ig等體積的生理鹽水，連續(xù)造模5d。觀察大鼠形態(tài)、行為變化及體質(zhì)量變化差異。第6天無菌取大鼠盲腸內(nèi)容物0.1 g,加生理鹽水0.9 mL,渦旋震蕩使均質(zhì)化，進(jìn)行10倍系列稀釋至1X10,選擇3個(gè)不同稀釋度，自高至低在相應(yīng)的培養(yǎng)基上接種100 pL稀釋液標(biāo)本，放入37“C電熱恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。其中雙歧桿菌培養(yǎng)基和乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)48~72 h,其余培養(yǎng)基需氧培養(yǎng)24~48 h。待菌落長出后，觀察其形態(tài)特征，計(jì)數(shù)菌落數(shù)，并計(jì)算每克盲腸內(nèi)容物中的細(xì)菌數(shù)量，單位為CFU/g。菌落數(shù)量=XX接種體積X稀釋倍數(shù)/標(biāo)本質(zhì)量X是同一稀釋度的平均菌落數(shù)。
2.1.2 大鼠形態(tài)、體質(zhì)量變化結(jié)果 對照組大鼠行動活躍，被毛光滑平整，飲食正常;抗生素組大鼠精神萎靡，畏寒扎堆，畏光，有鉆窩現(xiàn)象，被毛無光滑不平整，飲食量顯著下降，大便稀濕等?？股亟M實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量變化與對照組比較，差異不顯著(P>0.05)。
2.1.3 腸道菌群檢測結(jié)果 由腸道菌群檢測結(jié)果(表l)得知，與對照組比較，抗生素組大腸埃希菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌與總菌群均減少，差異顯著(P<0.05)。表明鹽酸林可霉素能造成正常大鼠腸道菌群失調(diào)。
2.2 給藥與樣品采集 24只SD大鼠隨機(jī)分為抗生素十黃芩苷組、抗生素+黃芩素組和黃芩苷組、黃芩素組，每組6只?？股?黃芩苷組和抗生素十黃芩素組用“2.1.1”項(xiàng)方法在造模后第6天分別ig給予等摩爾劑量(370pumol/kg)的黃芩苷和黃芩素。黃芩苷組和黃芩素組ig等量生理鹽水5d,第6天分別ig給予等摩爾劑量(370 pumol/kg)的黃芩苷和黃芩素。分別于給藥后0.5、1、2、4、6、7、8、9、10、12、16、20h經(jīng)尾靜脈取血0.5mL于肝素化離心管中，4000 r/min離心10min,分離上層血漿，保存于-20 "C的冰箱，待測。
2.3 大鼠血漿樣品中黃芩苷、黃芩素的定量測定
2.3.1 色譜條件 色譜柱為Thermo DimHypersilGOLD柱(100 mmX2.1 mm, 1.9 pum); 流動相為乙腈(A) -0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫: 0~8min, 10%-80%A; 8min, 80%-10%A;體積流量0.3 mL/min; 柱溫30 C;進(jìn)樣體積10pL。
2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源(ESI);檢測方式為正離子檢測方式;碰撞氣氬氣(Ar);輔助氣氮?dú)?N2);源電壓4kV;毛細(xì)管電壓3.5kV;毛細(xì)管溫度270 C;蒸發(fā)溫度300 C。采用一級全掃描質(zhì)譜(Full scan MS)和選擇反應(yīng)監(jiān)測模式(SRM)同時(shí)測定; 用于定量分析的離子反應(yīng)分別是m/z447-271 (黃芩苷)，m/z271-169 (染料木素， 內(nèi)標(biāo))，m/z271-123 (黃芩素)。
2.3.3 對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取黃芩苷、黃芩素對照品適量，用色譜甲醇配成含黃芩苷1.055mg/mL、黃芩素1.279 mg/mL的混合對照品儲備液。精密稱取染料木素適量，用色譜甲醇配成0.901 mg/mL內(nèi)標(biāo)儲備液。
2.3.4 血漿樣品處理 精密吸取血漿樣品100 pL,加入染料木素內(nèi)標(biāo)儲備液10 uL、0.5 mol/L HCI溶液50 uL，渦旋振蕩混勻，加入醋酸乙酯1 mL,振蕩液-液萃取10 min，4 000 r/min冷凍離心10 min,取上清液，用氮吹儀吹干(40 C)，最后用2 mL流動相(1:l) 渦旋復(fù)溶，0.22 um微孔濾膜濾過后進(jìn)樣10uL。
2.3.5 專屬性考察 分別取大鼠空白血漿，加入黃芩苷、黃芩素和內(nèi)標(biāo)染料木素對照品的空白血漿和實(shí)驗(yàn)組的含藥血漿樣品，按“2.3.4”項(xiàng)方法處理后進(jìn)樣。結(jié)果見圖1。本實(shí)驗(yàn)條件下，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾黃芩苷、黃芩素和內(nèi)標(biāo)物的測定，表明方法專屬性良好， 黃芩苷、黃芩素和內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間分別為4.71、5.66、6.01 min。
2.3.6 線性關(guān)系考察 分別取空白血漿100pL,加入10 uL混合對照品系列溶液，配成黃芩苷質(zhì)量濃度為4.220、2.110、1.055、0.528、0.264、0.132、0.066、0.013 ug/mL 和黃芩素質(zhì)量濃度為5.120、2.560、1.280、0.640、0.320、0.160、0.080.0.016 ug/mL系列對照品溶液，按“2.3.4”項(xiàng)方法處理并測定，記錄黃芩苷、黃芩素與內(nèi)標(biāo)物的峰面積。以黃芩苷(黃芩素)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，黃芩苷(黃芩素)與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y)，用加權(quán)(W=1/x?)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，黃芩苷: Y=0.0669 X-0.0117，(R=0.9996),黃芩素:Y=0.0322X+0.0527 (R=0.993 3)，黃芩苷在0.013~4.22 ug/mL 線性良好，黃芩素在0.016~5.12 ug/mL線性良好;黃芩苷和黃芩素的定量下限分別為0.013、0.016 ug/mL。
2.3.7 提取回收率 在空白血漿中加入已知量的黃芩苷、黃芩素對照品，制成黃芩苷高、中、低質(zhì)量濃度(4220、264、13 ng/mL)和黃芩素高、中、低質(zhì)量濃度(5 116、326、16 ng/mL)的質(zhì)控(QC)樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度樣品制備6份，按“2.3.4”項(xiàng)方法進(jìn)行樣品處理后，依法測定。另取空白血漿樣品，按“2.3.4”項(xiàng)方法進(jìn)行樣品處理，離心后得上清液，分別加入與上述相應(yīng)質(zhì)量濃度的對照品溶液，離心后吹千，殘留物用2 mL流動相復(fù)溶，處理后依法測定。以2種方法測得的黃芩苷、黃芩素峰面積比值計(jì)算提取回收率，測得高、中、低質(zhì)量濃度黃芩苷的提取回收率分別為87.8%、93.5%、90.4%，高、中、低質(zhì)量濃度黃芩素的提取回收率分別為89.1%、91.8%、94.9%，均在85%~115%，符合實(shí)驗(yàn)要求。
2.3.8 精密度與準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性考察 按“2.3.7”項(xiàng)方法制備3個(gè)不同質(zhì)量濃度的QC樣品,按“2.3.4”項(xiàng)方法處理后進(jìn)樣，考察日內(nèi)與日間精密度;考察室溫放置24h、-80 C反復(fù)凍融3次、-80。C保存20d、進(jìn)樣器放置24h后的穩(wěn)定性。測得高、中、低質(zhì)量濃度黃芩苷和黃芩素的日內(nèi)精密度RSD分別為4.2%、6.1%、6.3%，5.7%、4.5%、7.8%;高、中、低質(zhì)量濃度黃芩苷和黃芩素的日間精密度RSD分別為7.4%、8.2%、10.7%，6.2%、7.9%、11.4%，均低于15%，符合要求;準(zhǔn)確度以誤差(RE)表示均低于15%;室溫放置24h、-80 C反復(fù)凍融3次、-80 "C 下保存20d、進(jìn)樣器放置24h后黃芩苷和黃芩素的準(zhǔn)確度以RE表示均低于15%， RSD低于15%，符合要求。
2.3.9 基質(zhì)效應(yīng)考察 通過對比萃取后空白血漿與等濃度流動相中的黃芩苷(黃芩素)與內(nèi)標(biāo)的峰面積來評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。分別取空白血漿100 puL, 按*2.3.7”項(xiàng)下方法操作，采用處理后加入待測樣品及內(nèi)標(biāo)的方法，配制低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的黃芩苷(黃芩素)樣品，此法獲得的峰面積記為A，每-一質(zhì)量濃度平行制備6個(gè)樣品。低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的黃芩苷(黃芩素)對照品溶液直接進(jìn)樣后獲得的峰面積記為B，每一質(zhì)量濃度平行制備 3個(gè)樣品。A/B的值即為基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示:黃芩苷低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為88.17%、91.24%、91.12%; RSD分別為4.2%、4.8%、2.0%;黃芩素低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為87.62%、90.76%、92.15%; RSD分別為3.8%、4.2%、2.3%。結(jié)果表明本研究所確立的樣品處理檢測方法基質(zhì)效應(yīng)較小，對檢測目標(biāo)物質(zhì)具有特異性和針對性，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不影響目標(biāo)物質(zhì)的檢測。
2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用藥動學(xué)計(jì)算程序DAS 3.2.2 對大鼠血漿中黃芩苷(黃芩素)的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并用非房室模型進(jìn)行藥動學(xué)參數(shù)計(jì)算;采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件對所得參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較各組間的差異，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x士s表示。
2.5 藥動學(xué)結(jié)果及分析 各組大鼠血漿中的黃芩苷藥時(shí)曲線見圖2，黃芩苷的藥動學(xué)參數(shù)見表3。
2.5.1 大鼠ig黃芩苷后的藥動學(xué)特征 由圖2結(jié)果可知，菌群失調(diào)大鼠和正常大鼠ig黃芩苷后，黃芩苷的藥時(shí)曲線均出現(xiàn)多峰現(xiàn)象，在給藥后1 h血藥濃度達(dá)到第一個(gè)峰，在7~10 h黃芩苷血藥濃度最高，其原因可能是黃芩苷在體內(nèi)各部分(如胃、腸等部位)的吸收速度與程度不同，可能存在肝腸循環(huán)或其他循環(huán)。菌群失調(diào)大鼠ig黃芩苷后，體內(nèi)黃芩苷的藥時(shí)曲線低于正常大鼠的黃芩苷的藥時(shí)曲線，達(dá)峰時(shí)間(tmax) 也有所延遲，表明抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)后，影響了黃芩苷的吸收。由表3可知,抗生素十黃芩苷組血漿中黃芩苷的CmxAUCor分別為(7.80土5.52) mg/L、(32.60土18.88) h-mg/L顯著低于黃芩苷組的Cmax [(16.35士9.48) mg/L]和AUCo~r[(75.16士48.40) h-mg/L] (P<0.05)，V2/F、CL/F均顯著高于黃芩苷組，tmax、 t12高于黃芩苷組(P<0.05)，表明腸道菌群失調(diào)增加了黃芩苷在體內(nèi)的分布，加快了黃芩苷的消除速度，減緩了黃芩苷的吸收速度，最終抑制了黃芩苷的吸收程度;結(jié)果提示，腸道菌群失調(diào)抑制黃芩苷在大鼠體內(nèi)的吸收。
2.5.2 大鼠ig黃芩素后的藥動學(xué)特征 在本實(shí)驗(yàn)的給藥劑量下，ig給藥黃芩素后，黃芩素原型藥完全被代謝，在大鼠血漿中主要檢測到代謝產(chǎn)物黃芩苷，因此對血漿樣品中的黃芩苷進(jìn)行定量，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致"7]。有圖2和表3可知，正常大鼠ig黃芩素后，血漿中黃芩苷在2 h達(dá)血藥濃度高峰，提示黃芩素迅速被吸收;等摩爾劑量下，正常大鼠體內(nèi)，黃芩素組的黃芩苷的Cmax 和AUCa;均顯著高于黃芩苷組，V,/F、 CL/F均顯著低于黃芩苷組，tmax顯著短于黃芩苷組，這可能是ig黃芩素后，黃芩素迅速被吸收進(jìn)入血液循環(huán)，黃芩素在體內(nèi)分布減少，清除率降低，造成黃芩素組最終Cmax 和AUCo-1顯著增加(P<0.05)。給藥黃芩素后，相比于正常大鼠，抗生素處理大鼠體內(nèi)黃芩苷的 Cmax、AUCo顯著降低(P<0.05)，V2/F、CL/F均顯著升高(P<0.05)，tmax、tr顯著升高(P<0.05)， 提示腸道菌群失調(diào)，黃芩素的吸收程度降低了，在體內(nèi)的分布增加了，清除率提高，吸收速度減緩了;腸道菌群失調(diào)抑制黃芩素在大鼠體內(nèi)的吸收過程。
討論 幾乎所有的抗生素均能引起腸道菌群失調(diào)。林可霉素、頭孢類、其他青霉素類、氯霉素、大環(huán)內(nèi)酯類、 四環(huán)素類等抗生素均能誘導(dǎo)使腸道菌群紊亂[18-19]。其中，頭孢類和鹽酸林可霉素能在較短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)，停藥后失調(diào)狀態(tài)維持較長時(shí)間，其中鹽酸林可霉素所致腸道菌群失調(diào)維持時(shí)間最長1819]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用鹽酸林可霉素誘導(dǎo)大鼠腸道菌群失調(diào)，無菌采集盲d腸內(nèi)容物，通過麥康凱培養(yǎng)基、腸球菌瓊脂培養(yǎng)基、雙歧桿菌培養(yǎng)基、乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基，平板計(jì)數(shù)瓊脂選擇培養(yǎng)，分別對大腸埃希菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌與總菌群數(shù)量變化進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，與對照組比較，抗生素組大鼠的大腸埃希菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌與總菌群均減少，其存在顯著性差異(P<0.05), 提示抗生素組大鼠的腸道菌群紊亂。造模期間可觀察到抗生素組大鼠相對于正常大鼠毛色粗糙，糞便稀濕，出現(xiàn)較為嚴(yán)重的腹瀉癥狀，結(jié)合腸道菌群檢測結(jié)果，提示抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)成功。大鼠ig黃芩苷后，抗生素+黃芩苷組黃芩苷的吸收顯著低于黃芩苷組，推測抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)后，抑制了黃芩苷在大鼠體內(nèi)的吸收。大鼠ig黃芩素后，主要檢測到代謝產(chǎn)物黃芩苷，原形藥黃芩素低于檢測限，因此對血漿樣品中的黃芩苷進(jìn)行定量[17]?？诜S芩素后，黃芩苷在2h達(dá)血藥濃度高峰,提示黃芩素迅速被吸收;等摩爾劑量下，給藥黃芩素組的黃芩苷的Cmax 和AUCo-1均顯著高于黃芩苷組，這可能是由于口服黃芩素會被直接吸收，而口服黃芩苷，則需要微生物水解轉(zhuǎn)化為黃芩素后再被吸收，因此前者吸收黃芩素的藥量明顯高于后者，最終導(dǎo)致達(dá)峰濃度的增加[20]。本實(shí)驗(yàn)分別給予抗生素大鼠和正常大鼠等摩爾濃度的黃芩素，結(jié)果，抗生素組黃芩苷的吸收顯著低于正常組，推測抗生素誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)后，抑制了黃芩素在大鼠體內(nèi)的吸收。
本實(shí)驗(yàn)研究并比較黃芩苷和黃芩素在抗生素誘導(dǎo)菌群失調(diào)大鼠和正常大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)行為的差異，發(fā)現(xiàn)抗生素鹽酸林克霉素可導(dǎo)致大鼠腸道菌群失調(diào)，進(jìn)而抑制黃芩苷和黃芩素的吸收。本研究證實(shí)了抗生素類藥物由于其導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，減少了黃芩苷和黃芩素的吸收，降低了其藥理作用，因此臨床上將這類抗生素藥物與含黃芩苷、黃芩素藥物合用的科學(xué)性有待商榷。
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